基因组编辑技术正飞速发展，CRISPR-Cas系统作为一种新兴的基因定点编辑技术逐渐成熟并成功应用于多种动植物物种，促进了基因功能的研究。CRISPR-Ca系统是细菌和古细菌在进化过程中逐渐形成的一种适应性免疫系统，通过小片段的RNA介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、降解可以降解入侵的病毒或质粒DNA (Wiedenheft et al., 2012; Terns and Terns, 2011)。利用此技术能够对目的基因进行靶向的敲除或敲入。

虽然目前为止，对CRISPR-Cas9系统的作用机制尚未作出完全详细的论述，但其作用机制的整个过程已经基本明确，CRISPR-Cas9的作用机理(基本工作原理如图1)可分为三个阶段。第一阶段，CRISPR的高度可变的间隔区的获得，在噬菌体入侵的起始阶段，Cas蛋白复合物靶向并裂解噬菌体基因组中的原型间隔序列，间隔序列接下来整合到宿主基因组的CRISPR位点的5′端；第二阶段，CRISPR基因座的表达，这些插入的短间隔序列被转录成crRNA；第三阶段，CRISPR-Cas9系统发挥活性，对外源遗传物质进行干扰。在Cas蛋白复合物的参与下，靶向和干扰侵入的噬菌体DNA序列(李铁民和杜波, 2011; 方锐等, 2013)。

图1 CRISPR-Cas9工作原理示意图 Figure 1 Schematic diagram of CRISPR-Cas9

AG基因是最早克隆的花发育调控基因，与植物花器官(心皮, 胚珠, 果实等)的发育有密切关系。由于AG 基因与植物性别分化，开花结果等密切相关，因此研究AG的调控机制有一定的实际应用价值。本研究以拟南芥为材料，构建CRISPR-Cas9敲除拟南芥AG基因载体，建立稳定的敲除拟南芥基因的转化体系，并获得基因敲除的突变体。

1结果与分析

首先将靶位序列片段与克隆载体pUC19-U3连接，转化大肠杆菌，菌落PCR筛选阳性克隆(图2)，提取质粒为构建好的克隆载体pUC19-AG。中间克隆载体pUC19-AG利用EcoR I和Xba I双酶切回收520 bp左右片段(图3)，表达载体pCAMBIA1302- Cas9利用EcoR I和Nhe I分别酶切后过滤小片段并线性化。利用T4DNA连接酶连接520 bp片段和线性化表达载体，构建pCAMBIA1302-AG表达载体。

图2 菌落PCR筛选 注: M: DL2000 maker; 1: pUC19-AG; 2: pCAMBIA1302- AG Figure 2 Colony PCR screen Note: M: DL2000 maker; 1: pUC19-AG; 2: pCAMBIA1302- AG

图3 pUC19-AG酶切电泳图 Figure 3 Enzyme electrophoresis map of pUC19-AG

菌落PCR筛选引物为AG-P：5’-GCAAATCGTCTTCTCTAGCCGTGG-3’和OsU3D:CGGCTAGAGAAGACGATTTG。

表达载体构建过程中pCR筛选验证的电泳图说明表达载体已构建成功，并可以进行转入植物体内进行表达过程。

2讨论

虽然CRISPR系统的发现可以追溯到1987年，但是CRISPR-Cas9这种技术的应用研究还处于初始阶段，是近几年才逐渐发展起来的。该技术已经成功应用在多种微生物、动物细胞、动物和植物。2013年Nature Biotechnology同时报道了在重要作物水稻、小麦以及模式植物拟南芥和本生烟中取得了多个基因定点敲除、插入等基因组定点编辑的操作的成功案例，并首次证实CRISPR-Cas9系统能够在植物基因组中实现定点编辑(Shan et al., 2013; Feng et al., 2013;Li et al., 2013; Nekrasov et al., 2013)。

利用CRISPR-Cas9系统极性基因定点编辑可以用更加灵活性的方式实现只利用载体定点编辑同一个基因的不同位点和利用一个载体同时编辑多个靶位点。由于此系统的靶位点很短，只有20 bp左右，所以可以设计几个串联在一起的sgRNA，来实现对同一基因多个位点的同时编辑以及多个不同基因靶位点的编辑。同时定点编辑多个基因，可以有助于研究基因间的相互作用机制和研究同一基因家族的不同基因的功能。

CRISPR-Cas9在各项研究领域必将有越来越有广阔的应用前景，为基因组定向编辑领域的研究带来突破性的技术革命, 特别是在基因功能解析和加速重要农作物水稻、小麦性状改良与分子定向育种等方面(李君等, 2013)。

拟南芥作为模式植物，在分子研究领域有着植株小、结实多、生命周期短、基因组简单、遗传操作简便等优势，拟南芥基因组测序的完成使得大量涉及重要生命过程的基因被发现，对于开展遗传分析、基因克隆和功能研究意义重大。

3材料与方法

3.1植物材料

试验采用在实验室中培养室进行培养的拟南芥无菌苗。

3.2菌株与质粒

CRISPR-Cas9植物基因敲除系统包含克隆载体pUC19-U3和表达载体pCAMBIA1302-Cas9；本实验所用的大肠杆菌(E.coli)菌株为E.coli DH5α，农杆菌菌株为GV3101。

3.3酶和生化试剂

Taq酶、T4 DNA连接酶、Bbs I酶、EcoR I酶、Nhe I酶、DNA Maker DL 2000等试剂及DNA纯化回收试剂盒等。

3.3愈伤组织诱导

无菌环境下，切取实验室的无菌苗叶片，接种到1/2 MS基本培养基培养，附加激素2,4-D和6-BA进行处理：2,4-D的浓度设0、0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L和2.0 mg/L 5个梯度，6-BA的浓度为0.5 mg/L。每种培养基接种50个样，约21天后观察叶片愈伤形态，统计愈伤组织的诱导率。

3.4表达载体构建

3.4.1 AG基因敲除靶位引物序列设计

(1)在AG基因序列中设计一对20 bp的oligo DNA片段：5’-3’： ATCGTCTTCTCTAGCCGTGG。在基因的起始密码子ATG后，找到Cas9的识别位点PAM结构，找到PAM结构AGG(下划线标出)，在PAM结构前找20 bp序列片段设定为靶位序列：ATCGTCTTCTCTAGCCGTGG。5’-GTCGCACTCATCGTCTTCTCTAGCCG，PAM靶位点，TGGTCGTCTCTATG…3’，SgRNA-3’-UAGCAGAAGAGAUCGGC-5’

(2)设计敲除靶位序列：正义链AG-P：5’-GCA-AATCGTCTTCTCTAGCCGTGG-3’；反义链AG-D:5’-AAACCCACGGCTAGAGAAGACGAT-3’。其中GCAA和CAAA分别为上游和下游BbsI酶切形成的粘性末端，以连接线性化的pUC19-U3。引物由上海生工合成，纯化级别为PAGE。

3.4.2构建克隆载体pUC19-AG

(1)线性化克隆载体pUC19-U3。使用限制性内切酶Bbs I酶切克隆载体pUC19-U3载体，并利用DNA片段纯化试剂盒过滤除去22 bp片段，回收3.2 kb的线性化片段；pUC19-U3部分序列(标注下划线序列为酶切除序列)：5^,-CATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCAC-CTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGGATGATCCGTGGCAAgggtcttcgagaagacctGTTTTAGAGCTAGA-AATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTAGAGCTGGTTTGTGAAC-CGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCCGTTACATAACTTA-CGGTAAATGGCCCGCCTGGCTAACTAGAGATCTAGAGCGAC-3’。

3.4.3重组克隆载体pUC19-AG的构建

(1)插入片段制备。将AG敲除序列正负义链(100 μmol/L)等比例混合后，加热到95℃，3 min，自然冷却至40℃以下，得到所需双链DNA；

(2)正负义链连接反应，连接体系(表1)。将双链DNA与酶切纯化后的pP1C.2载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pP1C.2-AG载体；

表1 连接反应体系 Table 1 Ligation reaction system

(3)测序。对重组载体进行测序，确认插入序列的正确性。

3.4.4回收目的片段

利用EcoR I、Nhe I双酶切重组载体pUC19-AG，DNA回收试剂回收约520bp的DNA片段。

酶切反应：用EcoR I和Nhe I限制性内切酶对pUC19-AG重组载体双酶切，置于37℃进行双酶切反应3 h，然后置于常温下反应过夜，充分酶切，回收。酶切反应体系(表2)如下：

表2 EcoRI和NheI双酶切反应 Table 2 Double enzyme digestion reaction of EcoRI and NheI

3.4.5重组表达载体pCAMBIA1302- AG载体的构建

(1)线性化表达载体pCAMBIA1302-Cas9。用EcoR I和Xba I先后分别酶切pCAMBIA1302-Cas9，回收线性化片段。酶切反应：用EcoR I先对pCAMBIA1302-Cas9载体酶切，置于37℃进行双酶切反应3 h，然后置于常温下反应过夜，充分酶切，回收线性化载体。Nhe I酶切回收的线性化载体，置于37℃进行双酶切反应3 h，然后置于常温下反应过夜，充分酶切，回收连接反应需要的线性化片段。连接体系(表3)。

表3 酶切目的片段反应体系 Table 3 Enzyme reaction system of the objective gene fragment

(2)胶回收的520 bp DNA片段与酶切后的p-CAMBIA1302-Cas9利用T4 DNA酶进行连接，构建表达载体pCAMBIA1302-AG。

连接反应：连接体系(表4)，将反应体系置于16℃反应一周，大片段充分链接。转化大肠杆菌，筛选阳性克隆菌落。

表4 表达载体连接反应体系 Table 4 Ligation reaction system for the construction of transgenic vector

3.4.6转化与重组载体(pCAMBIA1302-AG)的筛选

取2~4 µL连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。热激法转化大肠杆菌与单克隆筛选：用PCR及质粒DNA双酶切鉴定后，提取质粒DNA，备用。碱法小量提取质粒DNA

3.5农杆菌转化

采用冻融法转化农杆菌，并进行菌落PCR验证，然后保存菌液，取700 mL菌液和300 mL甘油混于1.5 mL的Eppendorf管中，于-20℃保存，用于后续拟南芥的遗传转化实验。

作者贡献

王晓霞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；苏哲、岳彩云完成数据分析，负责论文初稿的写作，并参与研究实验及结果分析；樊金会是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

感谢山东农业大学林学院和生命科学与技术学院提供实验条件与技术支持。

参考文献

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